Tb-吡哌酸的荧光体系及尿和血清中吡哌酸含量的测定

摘要：本文报道了Tb一呲哌酸生成络合物后，在紫外光照射下发生分子内能量传递使Tb产生特征荧光，其荧光强度与呲哌酸的浓度成线性关系，由此建立了一种灵敏、快建的分析吡哌酸的方法。此方法具有背景干扰小，选择性高和体系中铽的荧光寿命长等特点。尤其适用于血清、尿样等体液分析，回收率在94．6%～102%，该方法检出限为3．6ng／mL其线性范围是5．0×10^-6～4．0×10^-6mol／L。

关键词：荧光光度法；铽；吡哌酸；血清；尿

引  言

  吡哌酸(PipemidicAcid，缩写为PPA)是喹喏酮类抗菌消炎药物，主要作用于细菌细胞的DNA旋转酶，干扰DNA的合成而使细菌死亡，包括绿脓杆菌在内的所有革兰氏阴性菌均有效，并对部分革兰氏阳性苗如金黄色葡萄环苗也有效吡哌酸与抗生素之间，00没有交叉耐药性，口服吸收良好，在体内几乎不被代谢，主要由尿中以原形物排泄，毒性较低在临床药理研究中需及时检测和了解眼药后不同阶段各组织中该药物的古量，因此建立曼敏、可靠、快速的分析方法十分必要。

目前分析毗哌酸的方法有紫外分光光度法、二阶导数分光光度法、非水滴定法、荧光法和示波授谱中和滴定法以上方法均用于片剂中吡哌酸含量的测定，分析生物样品时其中的蛋白质往往有干扰，而应用相系离子发光探针可以测定许多有机化合物该方法的突出特点是Stokes位移大，背景干扰小，选择性高。本文应用Tb—PPA络合物的荧光对血清及尿样中PPA含量进行分析，不需要预处理，该方法的检出限为3．6ng／mL。

1实验部分

1．1仪器与试剂

850型荧光分光光度计；UV-250紫外分光光度计；pHs-2型酸度计。

吡哌酸储备液(1．0×10^-3 mol／L)；由吡哌酸溶于少量的NaOH溶液中配制，避光保存。Tb^3+标准溶液(1．0×10^-3 mo1／L)；由一定量的Tb4O7用1：1盐酸溶解，水浴蒸发近干，再用二次重蒸水定容至100mL，避光保存在塑料瓶中。

缓冲浪：2-氨基-2-羟甲基-1，3-丙二酵-HCl(Tris)，0．1mol／L，pH=6～6．5。

1．2光谱测定

于10mL具塞试管中，依次加人2．0mL 1．0×10^-4mo1／L的Tb^3+针标准溶液、2．0ml 1．0×10^-6mo1／L 吡哌酸标准溶液，然后加人4．0mL pH=6．1的Tris缓冲溶液，用二次水定容至10mL，摇匀并放置20min，用1cm石英池，以试剂空白为参比，在日立-850荧光分光光度计上以激发通带为6．0nm，发射通带为8．5nm，加430nm滤光片的条件下，以一入ec=273nm为激发波长，在入en=544nm处测定体系的荧光强度F值，绘制F～吡哌酸浓度工作曲线。以同样的方法测定片剂及血清、尿样中吡哌酸的含量。

2结果与讨论

2．1吸收光谱和黄光光谱

吡哌酸在紫外区有2个吸收峰，波长分别位于260和330nm，吡哌酸与Tb^3+ 生成络合物之后，峰位发生了明显的位移，而且270nm处的强度明显增大，见图1这显然是由于络合物生成所致。

图2给出了PPA及其Tb-PPA配合物的激发光谱，由图2可以看到吡哌酸的激发峰位于273和330nm，Tb-PPA配合物的两个激发峰的位置与PPA的激发峰位基本相同，但强度显著增大吡哌酸的荧光峰位于445nm处，但当它与Tb^3+离子结合后，吡哌酸自身445nm处的荧光峰则显著减小，而在490、544、590和620nm处产生了Tb的特征荧光峰，峰形较窄，它们分别对应于Tb^3+的5D4→7F6，5D4→7F5，5D4→7F4和5D4→7F3跃迁。由Tb^3+水溶液的荧光光谱可知，Tb^3+的荧光强度极弱。由此可见Tb^3+的特征荧光峰是由于吡哌酸将吸收的能量传递给Tb^3+，从而敏化了Tb^3+的发光，与Tb^3+水合离子相比较极大地提高了Tb^3+ 的发光强度。

2．2溶液酸度

我们试验了不同pH值的缓冲体系，如硼砂、磷酸盐、氯化铵、醋酸铵、2-氨基-2-羟甲基-1，3-丙二醇-HCl(Tris)、2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇-HCl(Amp)、六次甲基四胺等七种体系。溶液酸度直接影响PPA解离和体系的荧光强度，图3给出了酸度对Tb-PPA体系荧光强度的影响。我们发现只有在pH6．0～6．5的Tris体系中Tb-PPA络合物的荧光强度最大且稳定性好。在强碱性条件下Tb^3+易水解在强酸性时吡哌酸发生质子化。均不利于Tb-PPA络合物的形成。

2．3 Tb^3+浓度的影响

Tb-吡哌酸络合物荧光强度的大小受Tb^3+抖浓度影响极大。Tb^3+浓度增大，有利于配合物的形成，并使Tb-PPA体系的荧光强度增大(见图4)实验中固定吡哌酸浓度为5×10^-7 mol／L，改变Tb^3+浓度，发现随着Tb^3+离子浓度逐渐增加，在445nm处Tb(Ⅱ)的特征荧光强度逐渐增大，同时在422nm处吡哌酸自身的荧光强度逐渐减小。当[Tb^3+]／[PPA]=40时，体系荧光强度趋于恒定。

2．4工作曲线、检测限豆精密度

按实验方法绘制工作曲线，呲哌酸在5．0×10^-6～4．0×10^-6 mol／L范围内与荧光强度F成线性关系。回归方程为F=0．8418+3．753×10^-6c，c为毗哌酸浓度(mol／L)。相关系数r=0．9975，该方法的检测限为3．6ng／mL。10次平行测定的相对标准偏差是1．4%，此方法精密度很好。

2．5配合物的组成

用摩尔比法、连续变化法和斜率比法测得Tb件与吡哌酸的络合比为1：3。

2．6样品测定

2．6．1片荆中吡哌酸舍量的测定

将l0片药片在研钵中均匀研细，再称取相当于一片药片质量的粉末，加0．1mol／L氢氧化钠溶解，于50℃水浴加热，促其溶解，过滤，定容至500mL，测定时稀释至所需浓度，用标准加入法进行测定，测定结果列于表1。

2．6．2血清及尿样中吡哌酸的回收率测定

对未经预处理的血清及尿液中吡哌酸进行测定时．往往会由于蛋白质的干扰使荧光信号减弱，回收率偏低。但本法只需将健康人的血清及屎液分别稀释1和2倍，蛋白质的干扰便可消除，标准加入法测定结果见表2。

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